液氮超低溫保存原理

　　超低溫——班德液氮罐冷凍保存的是液氮(一196℃)中使保存的活細胞物質(zhì)代謝和生長幾乎完全停止的保存方法。在這樣的冷凍條件下，調(diào)節(jié)和控制細胞生長代謝的各種酶的作用受到極大抑制，細胞內(nèi)部的生化反應十分緩慢，甚至停止，避免了細胞遺傳性狀的改變和遺傳漂變。在最佳條件下活化后，細胞仍可保持其原有的代謝活性。

　　1.1 冷卻過程中細胞受損傷的兩因素假說

　　在低溫冷凍過程中，冰晶的形成、滲透壓、保護劑毒性給細胞造成多種脅迫并對細胞有一定的損害，此方面以Mazur[63建立的“雙因素假說”最為著名。冷凍損傷由兩個獨立的因素造成：一是溶液損傷，如果冷卻速度很慢，則細胞在高濃度的溶液中暴露時間過長，為達到胞內(nèi)外溶液濃度平衡，水分由胞內(nèi)大量流出，細胞劇烈收縮，引起細胞內(nèi)原生質(zhì)和細胞器的變化;二是胞內(nèi)冰的形成，如果冷卻速率過快，則溶液中形成大量的冰晶，濃度急速升高，但因細胞膜的滲透率有限，胞內(nèi)溶液的水分子來不及滲出.造成過冷而結(jié)冰。

　　解凍速度過慢時，胞內(nèi)冰還會發(fā)生再結(jié)晶。在冷卻和解凍過程中形成的冰晶都可引起細胞體積變大或直接作用于細胞超微結(jié)構(gòu)而造成致命性機械損傷。因此為了實現(xiàn)細胞的超低溫保存需在溶劑中加入一定種類的低溫保護劑，如甘油、脫脂乳、蔗糖、二甲基亞砜等，不但可以減少胞內(nèi)水含量，還有保護細胞中大分子物質(zhì)的作用。

　　1.2溶液玻璃化理論

　　玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)的固化過程。它和常見的液體轉(zhuǎn)變?yōu)榫w或部分結(jié)晶的固體的凍結(jié)過程不同，玻璃態(tài)固體分子之間的關(guān)系和液態(tài)無明顯變化，而一般的晶體分子之間的關(guān)系和液態(tài)相差甚遠。使溶液玻璃化的途徑有兩條：一條是增加溶液中保護劑濃度，當降溫速度高于臨界冷卻速度時即可形成玻璃化，然而過高濃度的保護劑對細胞具有毒性作用;另一條是極大的提高冷卻速率，在冷卻過程中存在一個結(jié)晶高峰溫度范圍(240～200 K)被稱作“危險溫度區(qū)”，超快速冷卻顯著縮短了通過“危險溫度區(qū)”的時間，促進玻璃化的形成。